Evolution of equine influenza viruses (H3N8) during a Brazilian outbreak, 2015

Abstract Equine influenza is one of the major respiratory infectious diseases in horses. An equine influenza virus outbreak was identified in vaccinated and unvaccinated horses in a veterinary school hospital in São Paulo, SP, Brazil, in September 2015. The twelve equine influenza viruses isolated belonged to Florida Clade 1. The hemagglutinin and neuraminidase amino acid sequences were compared with the recent isolates from North and South America and the World Organisation for Animal Health recommended Florida Clade 1 vaccine strain. The hemagglutinin amino acid sequences had nine substitutions, compared with the vaccine strain. Two of them were in antigenic site A (A138S and G142R), one in antigenic site E (R62K) and another not in antigenic site (K304E). The four substitutions changed the hydrophobicity of hemagglutinin. Three distinct genetic variants were identified during the outbreak. Eleven variants were found in four quasispecies, which suggests the equine influenza virus evolved during the outbreak. The use of an out of date vaccine strain or updated vaccines without the production of protective antibody titers might be the major contributing factors on virus dissemination during this outbreak.

Influence of the inclusion of spray-dried animal plasma in weanling pigs' diet on porcine circovirus type 2 (PCV2) loads / Influência da inclusão do plasma sanguíneo na dieta de leitões desmamados sobre a carga viral de circovírus suíno tipo 2 (PCV2)

Spray-dried animal plasma (SDAP), a natural byproduct of the meatpacking industry, has been shown to have beneficial effects on growth and performance of weaned pigs. Porcine circovirus 2 (PCV2) is an important virus that is disseminated in the pork industry. Regardless of the studies evaluating the possible transmission of PCV2 through SDAP, there is no information about the effects of its inclusion in the PCV2 loads in natural infections. The present investigation evaluated the influence of dietary inclusion levels of SDAP in weanling pigs on PCV2 viremia and humoral immune response. Fifty-six weaned piglets were fed in a 2-period feeding program. Dietary treatments included 0%, 2%, 4% or 6% and 0%, 1%, 2% or 3% of SDAP during period 1 (14 to 28 days old) and 2 (29 to 42-days old), respectively. In period 3 (42 to 56 days old), all piglets received a SDAP-free diet. Serum samples were collected weekly and tested for PCV2 antibodies and DNA load. The results show that the concentration of 6% and 3% of SDAP on feed offered for pigs during period 1 and 2, respectively, may have decreased the PCV2 loads.(AU)

O plasma sanguíneo em pó (PSP), produto natural de indústria frigorífica, tem mostrado efeitos benéficos sobre o crescimento e desempenho de leitões desmamados precocemente. Atualmente, embora o circovírus suíno 2 (PCV2) tenha grande importância para a suinocultura, não há informações sobre o impacto do uso de PSP e a resposta imune ao PCV2 em infecções naturais. Este trabalho avaliou diferentes níveis de inclusão de PSP em dietas de leitões e as cargas virais de PCV2 correspondentes. Quatro níveis de inclusão de PSP foram testados em dois períodos consecutivos: 0, 2, 4 ou 6% durante o período 1 (14 aos 28 dias de idade) e 1, 2 ou 3% de PSP durante o período 2 (29 a 42 dias de idade). No período 3 (42 aos 56 dias de idade), todos os leitões foram alimentados com dieta isenta de PSP. Amostras de soro foram coletadas semanalmente e testadas para anticorpos anti-PCV2 e carga de DNA de PCV2. As concentrações de 6% e 3% de PSP fornecidas nas rações durante o período 1 e 2, respectivamente, influenciaram na carga viral de PCV2 de suínos naturalmente infectados.(AU)

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.(AU)

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.(AU)

Circovírus suíno 2b: isolamento e taxa de mutação em linhagem de célula de macrófagos (J744) / Porcine circovirus 2b: isolations and mutation rate in J744 lineage macrophage cell

Porcine circovirus 2 (PCV2) is associated with various clinical signs that are collectively designated as Circovirosis and has a great impact on the pig industry. The virus isolation is classically performed on PK-15 cell line, but other cells have been tested. Despite advances in studies with PCV2, isolation is still a challenge. The difficulty of maintaining these cell lines commonly used associated with the use of toxic substances to the isolation of PCV2 had stimulated the present study, that had the objectives to describe the first isolation of PCV2b in macrophage cell lines, J744 and verify the mutation rate at this system. A sample of lung was pooled and submitted to sequencing in which was classified in genotype PCV2b. This sample was used to inoculate a bottle of J744 with 30% of confluence in RPMI with 10% fetal bovine serum and submitted to five passages, which were accompanied by chain reaction quantitative polymerase (PCRq). The initial and final viral loads were 2.90 × 103 and 4.45 × 108 DNA copies/µL for PCV2b, respectively. Sequencing confirmed the isolation and had eliminated possible co-isolation of more than one genotype. After five passages, the isolate showed 99.7% identity with description of five point of non-synonymous or/and synonymous mutations observed in the cap and rep gene. The results demonstrate that J744 cells exhibit susceptibility, and the instability of the virus in J744 will be important for understanding the virus.

Porcine circovirus 2 (PCV2) está associado a vários sinais clínicos que são designados coletivamente como Circovirose e tem grande impacto na suinocultura. O isolamento viral é classicamente realizado em células da linhagem PK-15, contudo outras células têm sido testadas. Apesar dos avanços nos estudos com PCV2, o isolamento ainda é um desafio. Diante da dificuldade de manutenção dessas linhagens celulares comumente utilizadas associadas à necessidade do uso de substâncias tóxicas para o isolamento de PCV2, os objetivos do presente trabalho foram descrever o primeiro isolamento de Porcine circovirus 2b em linhagens de células de macrófago (J744) e verificar a taxa de mutação nesse sistema. Uma amostra de pulmão foi submetida ao sequenciamento e agrupada ao genótipo PCV2b. Essa amostra foi utilizada para inocular uma garrafa de J744 (com 30% de confluência em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino) e submetida a cinco passagens, as quais foram acompanhadas por reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq). As cargas virais inicial e final foram de 2,90 × 103 e de 4,45 × 108 cópias de DNA/µL para PCV2b, respectivamente. O sequenciamento confirmou o isolamento e descartou o coisolamento de mais de um genótipo. Após cinco passagens, o isolado apresentou identidade de 99,7%, com descrição de cinco mutações pontuais, uma sinônima e quatro não sinônimas, observadas nas regiões do gene cap e rep. Os resultados obtidos demonstram que as células J744 apresentam a susceptibilidade, e a instabilidade do vírus em J744 será importante para a compreensão do vírus.

Equine influenza in Brazil / A influenza equina no Brasil

Equine influenza virus (EIV) (H3N8 and H7N7) is the causative agent of equine influenza, or equine flu. The H7N7 subtype has been considered to be extinct worldwide since 1980. Affected animals have respiratory symptoms that can be worsened by secondary bacterial respiratory infection, thereby leading to great economic losses in the horse-breeding industry. In Brazil, equine influenza outbreaks were first reported in 1963 and studies on hemagglutination antibodies against viral subtypes in Brazilian horses have been conducted since then. The objective of the present review was to present the history of the emergence of EIV around the world and in Brazil and the studies that have thus far been developed on EIV in Brazilian equines...

O vírus da influenza equina (EIV) (H3N8 e H7N7) é o agente causador da influenza equina, ou gripe equina. O subtipo viral H7N7 é considerado como mundialmente extinto desde 1980. Os animais afetados têm sintomas respiratórios característicos que podem ser agravados por uma infecção respiratória bacteriana secundária causando grandes prejuízos no ramo equestre. No Brasil, os surtos da EI têm sido relatados desde 1963 e desde então vem sendo efetuados estudos sobre a presença de anticorpos hemaglutinantes contra os subtipos virais nos equídeos brasileiros. O presente artigo tem o objetivo de apresentar um histórico sobre o surgimento do EIV no mundo e no Brasil destacando os estudos conduzidos no Brasil até o momento acerca da infecção pelo EIV nos equídeos brasileiros...

In vitro interaction of bovine herpesvirus 1 with uterine tube epithelial cells and oocytes / Interação in vitro do herpesvírus bovino tipo 1 com células epiteliais da tuba uterina e oócitos

The aims of this study were to assess in vitro if bovine oocytes and oviductal epithelial cells from slaughterhouses for in vitro fertilization use may be infected with bovine herpesvirus 1; to analyze whether the treatment with trypsin according to the International Embryo Transfer Society guideline is efficient to inactivate the bovine herpesvirus 1; to morphologically study the virus-oocyte interaction through optical microscopy. In this study, Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) cells that were co-cultured with oocytes matured in vitro and exposed to bovine herpesvirus 1 showed a cytopathic effect. The nested polymerase chain reaction for the supernatant was positive for the bovine herpesvirus 1, thus suggesting that the cytopathic effect observed in the MDBK monolayer was seen due to virus replication and not because of any culture toxicity. It was also observed cytopathic effect and positive nested polymerase chain reaction in MDBK cells co-cultured with in vitro maturated oocytes free of virus, but that were co-cultured in uterine epithelial cells pre-infected with bovine herpesvirus 1 and washed or not with trypsin, demonstrating an oocyte contamination by the virus. When trypsin-washing efficacy was evaluated, we could observe that the trypsin treatment was not able to eliminate the bovine herpesvirus 1 of the oocytes, and it was not observed any morphological difference in the infected oocytes.(AU)

Os objetivos do presente estudo foram avaliar in vitro se oócitos bovinos e células epiteliais de oviduto provenientes de abatedouros para uso em fertilização in vitro podem ser infectados com o herpesvírus bovino tipo 1; analisar se o tratamento com tripsina padronizado pelo International Embryo Transfer Society é eficiente para inativar o herpesvírus bovino tipo 1; estudar morfologicamente a interação vírus e oócito pela microscopia óptica. Neste estudo, as células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), que foram cocultivadas com oócitos maturados in vitro e expostos ao herpesvírus bovino tipo 1, apresentaram efeito citopático. A reação em cadeia da polimerase aninhada ao sobrenadante foi positiva para o herpesvírus bovino tipo 1, sugerindo que o efeito citopático observado na monocamada MDBK foi em função da replicação do vírus, mas não devido a qualquer toxicidade da cultura. Também foram mostrados efeito citopático e reação em cadeia da polimerase aninhada positivos em células MDBK cocultivadas com oócitos maturados in vitro isentos de vírus, porém que foram cocultivados em células epiteliais uterinas previamente infectadas com herpesvírus bovino tipo 1, que se lavou ou não com tripsina, demonstrando uma contaminação pelo vírus do oócito. Quando foi avaliada a eficácia de lavagem com a tripsina, foi possível notar que este tratamento não foi capaz de eliminar o herpesvírus bovino tipo 1 dos oócitos, e não foi observada qualquer diferença morfológica nos oócitos infectados.(AU)

Presence of resiiratory viruses in equines in Brazil / Presença de vírus respiratórios em equinos do Brasil

Equines are susceptible to respiratory viruses such as influenza and parainfluenza. Respiratory diseases have adversely impacted economies all over the world. This study was intended to determine the presence of influenza and parainfluenza viruses in unvaccinated horses from some regions of the state of São Paulo, Brazil. Blood serum collected from 72 equines of different towns in this state was tested by hemagglutination inhibition test to detect antibodies for both viruses using the corresponding antigens. About 98.6% (71) and 97.2% (70) of the equines responded with antibody protective titers (≥ 80 HIU/25µL) H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses, respectively. All horses (72) also responded with protective titers (≥ 80) HIU/25µL against the parainfluenza virus. The difference between mean antibody titers to H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A viruses was not statistically significant (p > 0.05). The mean titers for influenza and parainfluenza viruses, on the other hand, showed a statistically significant difference (p < 0.001). These results indicate a better antibody response from equines to parainfluenza 3 virus than to the equine influenza viruses. No statistically significant differences in the responses against H7N7 and H3N8 subtypes of influenza A and parainfluenza 3 viruses were observed according to the gender (female, male) or the age (≤ 2 to 20 years-old) groups. This study provides evidence of the concomitant presence of two subtypes of the equine influenza A (H7N7 and H3N8) viruses and the parainfluenza 3 virus in equines in Brazil. Thus, it is advisable to vaccinate equines against these respiratory viruses.

Os equinos são susceptíveis aos vírus respiratórios, como o vírus influenza, e também tem sido citado o vírus parainfluenza. Doenças respiratórias têm impactado a economia em todo mundo. Este estudo intencionou determinar a presença dos vírus influenza e parainfluenza em equinos não vacinados de certas regiões do Estado de São Paulo, Brasil. Os soros coletados de 72 equinos, de diferentes cidades deste Estado, foram submetidos ao teste de Inibição da Hemaglutinação (IH) com objetivo de detectar anticorpos contra os referidos vírus, usando antígenos correspondentes. Cerca de 98,8% (72) e 97,2% (70) desses equinos responderam com títulos protetores (≥ 80 UIH/25µL) para os subtipos H7N7 e H3N8 de vírus influenza, respectivamente. Todos equinos (72) responderam com títulos protetores (≥ 80 UIH/25µL) contra o vírus parainfluenza 3. A diferença entre as médias de anticorpos contra o vírus influenza A não foi estatisticamente significante (p > 0,05). As médias de títulos dos vírus influenza e parainfluenza, por outro lado, demonstraram diferença estatisticamente significante (p < 0,001). Esses resultados indicam melhor resposta de anticorpos pelos equinos ao vírus parainfluenza 3 do que ao vírus da influenza equina. Nenhuma diferença estatística foi observada nas respostas contra os vírus da influenza equina A (H7N7 e H3N8) e parainfluenza 3, com relação ao gênero (fêmeas e machos) e grupo etário (≤ 2 até 20 anos) nos equinos avaliados. Este estudo fornece evidência da presença concomitante dos dois subtipos vírus influenza A (H7N7 e H3N8) e do parainfluenza 3 em cavalos no Brasil. Portanto, é aconselhável a vacinação dos cavalos contra esses vírus respiratórios.

Molecular epidemiology of rabies virus isolated of herbivores from Brazilian Amazon / Epidemiologia molecular de vírus da raiva isolados de herbívoros procedentes da Amazônia brasileira

Rabies virus samples (n = 17) A1 to A3 exhibit a similar composition and geographic distribution. Diverse composition of remaining groups of N and G gene is attributable to different sequences used in the alignments for each genomic region. Glycoprotein amino acid sequence showed molecular markers in sub-lineages A2, A3, A4 and A7. This information provides a better comprehension of molecular epidemiology of rabies, starting with the knowledge of viral lineages circulating in the Brazilian Amazon.

Amostras do vírus da raiva (n = 17) isoladas de bovinos (n = 11), equinos (n = 4) e bubalinos (n = 2) procedentes do Pará (n = 7), Tocantins (n = 6) e Rondônia (n = 4) foram submetidas à técnica de RT-PCR para amplificação parcial dos genes da Nucleoproteína (N) e Glicoproteína (G). As sequências nucleotídicas obtidas foram analisadas pelo método de reconstrução filogenética Neighbor-Joining com o modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros. Todas as 17 amostras pertenceram ao cluster A, que se encontrou na linhagem associado com morcego hematófago Desmodus rotundus. A análise filogenética baseada nos genes N e G, sugere a presença de cinco sublinhagens (A1-A5) e sete sublinhagens (A1-A7), respectivamente. Quando se compara ambas as filogenias, as sublinhagens A1 até A3 mostram composição e distribuição geográfica concordante, já a diversidade observada na composição das sublinhagens restantes é atribuída ao uso de sequências de diferentes alinhamentos. A glicoproteína mostrou marcadores moleculares nas sublinhagens A2, A3, A4 e A7, o que fornece elementos para melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva das linhagens circulantes na Amazônia Brasileira.

Spotted fever group Rickettsia infecting ticks (Acari: Ixodidae) in the state of Santa Catarina, Brazil

During 2006-2008, a total of 260 adult ticks were collected from domestic and wild animals in different regions of the state of Santa Catarina (SC), Brazil, including areas where human cases of Brazilian spotted fever have been reported. Collected ticks belonging to nine species (Amblyomma aureolatum, Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Amblyomma longirostre, Amblyomma ovale, Amblyomma tigrinum, Dermacentor nitens, Rhipicephalus microplus and Rhipicephalus sanguineus) were tested by polymerase chain reaction (PCR) for rickettsial infection. Overall, eight (3.1 percent) ticks were found to be infected with Rickettsia species. After sequencing the PCR products, we determined that the sequences generated from three A. aureolatum, one A. ovale and one R. sanguineus from the municipality of Blumenau, one A. ovale from the municipality of Águas Mornas and one A. ovale from the municipality of Urussanga were identical to the corresponding partial rickettsial ompA gene sequence of Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. The sequence generated from one A. longirostre from Blumenau was 100 percent identical to the corresponding partial rickettsial ompA gene sequence of Rickettsia amblyommii strain AL. Because R. parkeri strain Atlantic rainforest was recently shown to have caused two cases of human spotted fever in other states of Brazil, the role of this rickettsial agent as a possible etiological agent of spotted fever in SC is discussed.

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.

Occurrence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. isolated from domestic animals in a rural area surrounding Atlantic dry forest fragments in Teodoro Sampaio municipality, State of São Paulo, Brazil / Ocorrência e caracterização molecular de Cryptosporidium spp. isolados de animais domésticos de propriedades rurais circunvizinhas a fragmentos de Floresta Atlântica Seca do Estado de São Paulo, Brasil

The aim of this study was to assess the occurrence of Cryptosporidium in domestic animals in rural properties surrounding rain forest fragments within the municipality of Teodoro Sampaio, southeastern Brazil. Conventional sucrose flotation method followed by molecular characterization of the parasites by sequencing PCR products amplified from SSU rRNA gene were used. Stool samples were collected from domestic animals raised as pets and livestock in all rural properties surrounding three forest fragments. Samples from cattle (197), equine (63), pigs (25), sheep (11), and dogs (28) were collected from 98 rural properties. The frequency of occurrence of Cryptosporidium within each animal species was 3.0 percent (6/197) among cattle and 10.7 percent (3/28) among dogs. Cryptosporidium was not detected in stool samples from equine, sheep, and pigs. All sequences obtained from the six samples of calves showed molecular identity with Cryptosporidium andersoni while all sequences from dog samples were similar to C. canis. The frequency of occurrence of Cryptosporidium in these domestic animal species was low. The absence of C. parvum in the present study suggests that the zoonotic cycle of cryptosporidiosis may not be relevant in the region studied. The presence of Cryptosporidium species seldom described in humans may be, otherwise, important for the wild fauna as these animals are a source of infection and dissemination of this protozoan to other animal species. The impact and magnitude of infection by C. andersoni in wild ruminants and C. canis in wild canids have to be assessed in future studies to better understand the actual importance of these species in this region.

O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de Cryptosporidium, em animais domésticos de propriedades rurais ao redor de fragmentos de mata Atlântica de interior no município de Teodoro Sampaio, por exame convencional de flutuação em solução de sacarose, seguido de caracterização molecular dos parasitas através do sequenciamento dos produtos amplificados na PCR do gene SSU rRNA. Foram coletadas amostras fecais de animais domésticos criados para subsistência e estimação nas propriedades rurais do entorno de três fragmentos florestais. Amostras de bovinos (197), equinos (63), suínos (25), ovinos (11) e cães (28) foram coletadas de 98 propriedades rurais. A ocorrência de Cryptosporidium para a espécie bovina foi de 3,0 por cento (6/197); para os cães, de 10,7 por cento (3/28); e para os demais animais os resultados foram negativos. Todas as sequências obtidas das seis amostras de bovinos apresentaram identidade molecular com Cryptosporidium andersoni, enquanto as sequências oriundas de amostras de fezes de cães revelaram-se similares ao C. canis. A ocorrência do Cryptosporidium entre os animais estudados foi baixa. Diante dos resultados do presente estudo, o ciclo zoonótico da criptosporidiose parece ter menos importância nesta região. A presença de espécies de Cryptosporidium ainda pouco relatadas em humanos pode ser, por outro lado, importante para a fauna silvestre, uma vez que estes animais podem ser considerados como uma fonte de infecção e disseminação deste protozoário. O impacto e a magnitude da infecção de C. andersoni, em ruminantes selvagens, e de C. canis, em cães silvestres, deve ser avaliado em estudos futuros, com intuito de verificar a real importância dessas espécies nesta região.

Differentiation of Bovine coronavirus (BCoV) genotypes by a restriction enzyme assay

This article reports the use of the GsuI restriction enzyme to differentiate genotypes of Bovine Coronavirus (BCoV), based on an 18-nucleotide deletion of S1-coding region found in one of the two genotypes. It was concluded that this assay can be used as a rapid tool for BCoV genotypes differentiation.

The cap gene of porcine circovirus type 2 (PCV2) evolves by positive selection in vitro / O gene cap de circovírus suíno tipo 2 (PCV2) evolui por seleção positiva in vitro

This article reports the genetic divergence of PCV2 after passages in VERO and SK-RST cell lines. Fisher’s exact test indicated a trend for positive selection on the cap gene. These results allow insights on the development of PCV2 vaccines and the evolution of the genus Circovirus.

Este artigo relata a divergência genética de PCV2 após passagens em células das linhagens VERO e SK-RST. O teste exato de Fisher indicou tendência para seleção positiva no gene cap. Estes resultados permitem inferências relativas ao desenvolvimento de vacinas contra PCV2 e sobre a evolução do gênero Circovirus.

Etiologic diagnosis of bovine infectious abortion by PCR / Diagnóstico etiológico de aborto infeccioso bovino por PCR

Infectious abortion is a significant cause of reproductive failure and economic losses in cattle. The goal of this study was to detect nucleic acids of several infectious agents known to cause abortion including Arcanobacterium pyogenes, Bovine Herpesvirus 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum, and Tritrichomonas foetus. Tissue homogenates from 42 fetuses and paraffin-embedded tissues from 28 fetuses and 14 placentas/endometrium were included in this study. Brucella abortus was detected in 14.2 percent (12/84) of the samples. Salmonella sp. DNA was amplified from 2 fetuses, and there was one positive for Neospora caninum, and another for Listeria monocytogenes. This PCR-based approach resulted in identification of the etiology in 19 percent of samples, or 20 percent if considered fetal tissues only.

Aborto infeccioso é uma causa significativa de falhas reprodutivas e perdas econômicas na bovinocultura. O objetivo deste estudo foi detectar ácidos nucleicos de vários agentes infecciosos reconhecidos como causadores de aborto, incluindo-se Arcanobacterium pyogenes, Herpesvirus bovino tipo 1, Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, Chlamydophila abortus, Leptospira sp., Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Neospora caninum e Tritrichomonas foetus. Homogenados de tecidos de 42 fetos e tecidos incluídos em parafina de 28 fetos e 14 placentas/endométrio foram incluídos neste estudo. Brucella abortus foi detectada em 14,2 por cento (12/84) das amostras. DNA de Salmonella sp. foi amplificado de dois fetos e houve um feto positivo para Neospora caninum e outro para Listeria monocytogenes. Essa metodologia baseada em PCR resultou na identificação da etiologia em 19 por cento das amostras ou 20 por cento se considerados somente os tecidos fetais.

Pesquisa de Rickettsia spp em carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum no Estado de São Paulo / Survey of Rickettsia spp in the ticks Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum in the State of São Paulo

Foi pesquisada a presença de riquétsias em 3.545 carrapatos Amblyomma cajennense e 2.666 Amblyomma dubitatum. Através do teste de hemolinfa, reação em cadeia pela polimerase e isolamento de rickettsia em cultivo celular, todos os Amblyomma cajennense foram negativos, sendo que 634 (23,8 por cento) Amblyomma dubitatum mostraram-se infectados com Rickettsia bellii.

The presence of rickettsial infection was surveyed in 3,545 Amblyomma cajennense ticks and 2,666 Amblyomma dubitatum ticks. Using the hemolymph test, polymerase chain reaction and isolation of Rickettsia in cell cultures, all of the Amblyomma cajennense were negative, whereas 634 (23.8 percent) of the Amblyomma dubitatum ticks were shown to be infected with Rickettsia bellii.

Experimental infection of vampire bats Desmodus rotundus (E. Geoffroy) maintained in captivity byfeeding defibrinated blood added with rabies vírus / Infecção experimental de morcegos hematófagos Desmodus rotundus(E. Geoffroy) mantidos em cativeiro e alimentados com sangue desfibrinado adicionado de vírus da raiva

In vampire bats, food sharing behavior would contribute for the oral transmission of rabies virus among the roostmates. To test this hypothesis, 10 captive Desmodus rotundus bats were fed defibrinateds wine blood containing mice brain suspension of PV-strain of rabies virus. Other 10 bats were fed blood mixed with a mice brain suspension of T-9/95 vampire-bat-field isolate of rabies virus. Another group of 10 bats was inoculated intramuscularly with a mice brain suspension of the T-9/95 isolate. Other 20 bats were maintained without treatment and fed defibrinated swine blood for 158 days. All animals found dead during the observation period or those sacrificed at the end of the experiment were necropsied and specimens such as the brain and non-nervous tissues were collected for rabies examination. Four bats inoculated intramuscularly developed clinical rabies, with signs lasting 1-2 days, and the survival periods ranged from 11-14 days. The initial rabies diagnosis was based on direct fluorescent antibody (dFA) and mouse inoculation test (MIT) performed only on brain specimens, and subsequently, brains andthe non-nervous materials were further reexamined by means of dFA, MIT and heminested-polymerase chain reaction (ht-PCR)technique. The intake of the PV-strain caused rabies in 2 bats, with survival period of 25 and 32 days, while the three bats ingesting theT-9/95 isolate presented periods of 26-31 days. Although discrepant results were found among the diagnostic tests, viruses have disseminated to the central nervous system and other organs, as seenin bats inoculated intramuscularly

Em morcegos hematófagos, o hábito de compartilhar alimentopoderia contribuir na transmissão oral do vírus da raiva. Para verificar esta hipótese, 10 morcegos Desmodus rotundus em cativeiro foram alimentados com sangue suíno desfibrinado, contendo suspensão de cérebros de camundongos infectados com vírus rábico PV. Outros 10 camundongos receberam sangue contendo suspensão cerebral de camundongos infectados com vírus de morcego hematófago (T-9/95). Um grupo de 10 camundongos foi inoculado intramuscularmente com suspensão de vírus T-9/95. Outros 20 morcegos foram mantidossem tratamento e alimentados com sangue desfibrinado por 158 dias. Todos os animais encontrados mortos durante o período de observação ou sacrificados no final do experimento foram necropsiados e os cérebros e órgãos não-nervosos foram colhidos para a confirmação da raiva. Quatro morcegos inoculados intramuscularmente apresentaram raiva clínica, com sinais persistind opor 1-2 dias e os períodos de sobrevivência variaram de 11-14 dias. O diagnóstico da raiva inicialmente foi realizado somente com os fragmentos do cérebro, submetendo-os às provas de imunoflurescência direta (IFD) e inoculação em camundongos (IC).Subseqüentemente, os cérebros e os órgãos não-nervosos foram reexaminados com as técnicas de IFD, IC e heminested-polymerase chain reaction (ht-PCR). A ingestão do vírus PV causou raiva em dois morcegos, com período de sobrevivência de 25 e 32 dias, enquanto que os três morcegos que ingeriram o isolado T-9/95 apresentaram períodos de 26-31 dias. Embora encontrando resultados discrepantes entre as técnicas diagnósticas utilizadas, os vírus ingeridos pelos morcegos foram detectados no sistema nervoso central e outros órgãos não-nervosos, como nos morcegos inoculados intramuscularmente

A coronavirus detected in the vampire bat Desmodus rotundus

This article reports on the identification of a group 2 coronavirus (BatCoV DR/2007) in a Desmodus rotundus vampire bat in Brazil. Phylogenetic analysis of ORF1b revealed that BatCoV DR/2007 originates from a unique lineage in the archetypical group 2 coronaviruses, as described for bat species elsewhere with putative importance in Public Health.

Antigenic characterization of canine parvovirus isolates from Brazil using specific monoclonal antibodies / Caracterização antigênica de isolados de parvovirus canino do Brasil utilizando monoclonais específicos

Canine parvovirus (CPV) is an emerged pathogen in dogs, first isolated in 1978 in the USA. The original 1978 strain was designated CPV type 2 (CPV-2). However, analysis of CPV isolates in the USA by restriction enzymes and monoclonal antibodies have shown that around the year 1979 a CPV variant strain, designated CPV type 2a (CPV-2a), became widespread. Subsequently, a new antigenic strain, designated CPV type 2b (CPV-2b), was also observed by analysis of CPV isolates from various parts of the world, although the proportion of each strains was different between countries. In this study, the Haemagglutination Inhibition (HI) test with a panel of monoclonal antibodies was used to type canine parvovirus strains in 29 fecal samples collected from symptomatic dogs from 1980 to 1986 and from 1990 to 1995. The results showed a strong predominance of the antigenic type 2a indicating that the CPV epizooty in Brazil followed the same pattern observed in European and Asian countries.

O Parvovírus Canino (CPV) é um patógeno emergente em cães, isolado pela primeira vez em 1978, nos Estados Unidos. A amostra original de 1978 foi designada CPV tipo 2 (CPV-2). Entretanto, análises de isolados de CPV dos Estados Unidos, por enzimas de restrição e anticorpos monoclonais demonstraram que cerca de 1979, uma amostra variante, designada CPV tipo 2a (CPV-2a) tornou-se prevalente. Subseqüentemente, uma nova amostra antigênica, designada CPV tipo 2b (CPV-2b) também foi observada por análises de isolados de CPV de várias partes do mundo, embora a proporção fosse diferente entre os países. Nesse estudo, foi utilizado o teste de Inibição da Hemaglutinação (HI) com um painel de anticorpos monoclonais para a tipagem de 29 amostras fecais de parvovirus canino, coletadas de cães sintomáticos de 1980 a 1986 e de 1990 a 1995. Os resultados indicaram uma forte predominância do tipo antigênico 2a indicando que a epizootia de CPV no Brasil seguiu o mesmo padrão observados na Europa e países Asiáticos.

Experiments on intramuscular inoculation and feeding domestic cats (Felis catus) with brains of mice previously infected by rabies viruses

Nineteen kittens divided into four groups were fed with brains of mice infected with rabies viruses. Each four kittens (group I) received four brains infected with the PV fixed strain; nine kittens (group II) ingested 4-5 brains infected with the field isolate T-9/95, isolated from the Desmodus rotundus vampire bat; two kittens (group III) fedten T-9/95-infected brains, and four cats consumed 32-37 PV strain infected brains. One adult male, inoculated into masseter muscle with a 20% T-9/95-infected brain suspension, presented rabies after an incubation period of six days, followed with 8 days of clinical evolution, and died there after and this cat was considered as the rabies “positive standard”. After observing for 20-230 days, all the cats feeding the rabid brains were submitted to euthanasia, by using Acepran®, Zoletil®,and T-61®. At necropsy, samples of brain, heart, lung, kidney, submaxillary salivary gland, and cervical medulla were collected from all the cats and further submitted to the direct fluorescence antibodytest (dFA), mouse inoculation test (MIT) and to the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. Brain, cervical medulla, and the submaxillary salivary gland of the positive standard cat were dFA-positive, and brain and cervical medulla were positive for MIT. All specimens of this cat tested by the RT-PCR were found positive. No animals ingesting PV or T-9/95 virus-infectedbrains developed clinical signs and all materials tested were negativeby dFA and MIT. Several specimens, however, showed positive reactions by the RT-PCR technique, but cats were resistant to rabies through the viruses administered orally.

Dezenove gatos, divididos em quatro grupos, foram alimentadoscom cérebros de camundongos infectados com vírus de raiva. Cada um dos quatro gatos (grupo I) receberam quatro cérebros infectados com vírus fixo PV; nove gatos (grupo II) ingeriram 4-5 cérebros infectados com uma amostra de campo T-9/95, isolada do morcego Desmodus rotundus; dois gatos (grupo III) ingeriram 10 cérebros infectados com T-9/95 e quatro gatos (grupo IV) ingeriram 32-37 cérebros infectados com vírus PV. Um macho adulto, inoculado no músculo masséter, com uma suspensão cerebral a 20% da amostra T-9/95, desenvolveu raiva após período de incubação de seis dias,seguidos por oito dias de evolução clínica, morrendo em seguida. Este gato foi denominado de “padrão positivo”. Após observação por um período de 20-230 dias, todos os gatos que receberam cérebros foram submetidos à eutanásia, utilizando Acepran®, Zoletil® e T-61®. À necropsia, foram colhidas amostras do cérebro, coração, pulmão,rim, glândula salivar submaxilar e medula cervical e submetidas à prova de imunofluorescência direta (IFD), inoculação em camundongos (IC), e reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR). No “padrão positivo”, cérebro, medula cervical eglândula salivar foram positivos à IFD e à IC, cérebro e medula cervical foram os positivos. Todos os espécimes do “padrão positivo” foram positivos à RT-PCR. Nenhum animal que ingeriu cérebros contendo amostras de vírus PV ou T-9/95 apresentou sinais clínicos e todos osespécimes testados foram negativos à IFD e IC, no entanto, alguns espécimes reagiram positivamente à RT-PCR, porém, os gatos foram resistentes à raiva com vírus administrados oralmente. Master thesis submitted to the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the University of São Paulo, on June 24th, 2003. Fellowship from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP, process No. 01/07188-8.

Soroprevalência da encefalomielite eqüina do leste e do oeste no Município de Uruará, PA, Brasil / Seroprevalence of holders farms for eastern equine encephalitis and western equine encephalomyelitis in Uruará Municipality, Pará State, Northen Brazil

O objetivo do presente foi estimar a soroprevalência de anticorpos contra o vírus da EEE e da WEE utilizando como unidades de análise os eqüídeos e as propriedades rurais do tipo familiar do município de Uruará, PA. Os anticorpos contra o vírus das EEE e da WEE foram pesquisados pela microtécnica de soroneutralização. As seguintes prevalências de animais sororeatores para os diferentes vírus foram observadas: EEE 27,37% (IC 15,33 - 39,21%), WEE 1,05% (IC 0,06 - 6,78%). Para as propriedades obtivemos as seguintes prevalências: EEE 53,12% (IC 35,03 - 70,49%), WEE 3,12% (IC 0,16-18,00%).

The aim of this study was to verify the prevalence of herds with EEEV and WEEV infected animals, in Uruará municipal district, Pará State-Brazil. In view of that, the serum neutralization test was utilized. The following prevalence of positive herds were observed: 17 positive herds for EEEV out of 32 herds, therefore, prevalence is 53.12% (IC 35.03 - 70.49%). One positive herd was found for WEEV out of the 32 studied herds, thus performing 3.12% (IC 0.16 - 18.00%) prevalence. The prevalence of serum reactors animals were observed: 27,37% (IC 15,33 - 39,21 %), WEE 1,05% (IC 0,06 - 6,78%).